PESQUISA VETERINÁRIA BRASILEIRA

Abstract in English:

The aim of this study was to evaluate serum protein and serum IgG concentrations (after a direct enzyme immunoassay test ELISA optimization) in newborns foals from birth to thirty days of life before and after colostrum consumption and intravenous treatment with plasma. Twenty foals and their respective progenitors as well as four plasma donor’s horses were used. Blood samples were obtained from newborn foals at five time points, immediately after birth and before colostrum intake (M1), ten hours after birth (M2), 24 hours after birth and prior administration of blood plasma (M3), 48 hours after birth and 24 hours after plasma administration (M4), and 30 days after birth (M5). Blood and colostrum samples were collected from the progenitor mares immediately postpartum. Concentration of total protein (TP) and albumin were determined using a biochemical analyzer. The TP concentration was also measured by refractometer. Fractions of total serum protein were separated using agarose gel electrophoresis. Colostrum density was evaluated using BRIX refractometer and specific density colostrometer. Total IgG concentration was determined by an enzyme-linked immunosorbent assay. With the ELISA system proposed here it was possible to determine IgG concentrations in serum, plasma, and equine colostrum samples with adequate repeatability. Serum IgG concentration in foals at birth was 15±8mg/dL (mean ± standard deviation) raising at ten hours (2,408±608mg/dL) and remaining at similar levels up to 48 hours of life (2,364±784mg/dL), and decreasing significantly at 30 days of age (1,414±586mg/dL). Serum and colostrum IgG concentrations of mares were 1,746±505mg/dL and 7,714±2,619mg/dL, respectively. The plasma IgG concentrations from donor mares were 2,026±148mg/dL. Total protein, total globulins, and γ-globulin fraction showed correlation with IgG. Ten hours post birth was an adequate time to verify the transfer of passive immunity, allowing to adoption prophylactic and/or therapeutic measures in a horse farms. One liter of plasma administered at 24 hours of life was not sufficient to raise serum IgG concentrations in foals without passive immunity transfer failure.

• Proteinogram IgG foals plasma equine enzyme immunoassay electrophoresis immunoglobulins proteins

Abstract in Portuguese:

Este trabalho teve por objetivo avaliar o proteinograma e concentrações séricas de IgG (após a padronização de teste ELISA) em potros do nascimento aos trinta dias de idade, antes e depois de mamarem colostro e serem tratados com plasma por via intravenosa. Foram utilizados 20 potros e suas respectivas mães, além de quatro animais doadores de plasma. Foram colhidas amostras de sangue dos potros em cinco momentos, logo após o nascimento e antes de mamar colostro (M1), dez horas após nascimento (M2), 24 horas após nascimento e previamente administração do plasma sanguíneo (M3), 48 horas de vida e 24 horas após administração do plasma sanguíneo (M4), e 30 dias após nascimento (M5). Foram colhidos sangue e colostro das éguas progenitoras no momento do parto. A concentração de proteína total (PT) e albumina foram determinadas em analisador bioquímico, a concentração de PT também foi avaliada em refratômetro manual. O fracionamento proteico foi realizado utilizando eletroforese em gel de agarose. A densidade do colostro foi avaliada com colostrômetros de refração BRIX e de densidade específica. A concentração de IgG total de todas as amostras foi determinada por teste ELISA. Com o sistema de ELISA aqui proposto foi possível determinar concentrações de IgG em amostras de soro, plasma e colostro equino com adequada repetibilidade. A média ± desvio padrão da concentração sérica de IgG dos potros ao nascer, foi de 15±8mg/dL, com dez horas de vida foi de 2.408±608mg/dL, se manteve em níveis semelhantes até 48 horas (2.364±784mg/dL) e diminuíram significativamente aos 30 dias de vida (1.414±586mg/dL). A concentração sérica e colostral de IgG nas éguas foi de 1.746±505mg/dL e 7.714±2.619mg/dL, respectivamente. A concentração plasmática de IgG dos doadores de plasma foi de 2.026±148mg/dL. Houve correlação positiva entre as concentrações séricas de IgG e PT (r=0,69 para refratômetro e r=0,76 para bioquímico), GT (r=0,81) e gamaglobulina (r=0,85). Dez horas após o nascimento foi possível verificar a transferência de imunidade passiva, possibilitando adotar medidas profiláticas e/ou terapêuticas em haras de criação de cavalos. Considerando que a proteína total, globulinas totais e fração γ-globulina apresentam correlação com IgG, estas determinações são úteis para monitorar os potros após mamarem o colostro. Um litro de plasma administrado às 24 horas de vida não foi suficiente para aumentar as concentrações séricas de IgG, 24 horas após transfusão, em potros com adequada transferência de imunidade passiva.

• Proteinograma IgG potros plasma equinos imunoensaio enzimático eletroforese imunoglobulina proteínas

Abstract in English:

ABSTRACT.- Cruz T.F., Kanashiro T.M., Castro A.M.M.G., Baldin C.M., Richtzenhain L.J. & Araujo Jr J.P. 2016. A double-antibody sandwich ELISA based on the porcine circovirus type 2 (PCV2) propagated in cell culture for antibody detection. Pesquisa Veterinária Brasileira 36(12):1171-1177. Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: jpessoa@ibb.unesp.br, tfcruz@yahoo.com.br Few studies have described enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the detection of antibodies against porcine circovirus type 2 (PCV2) based on antigens produced in cell culture. Furthermore, few articles have described viral purification techniques for members of the family Circoviridae. This occurs because circoviruses are difficult to isolate, noncytopathogenic, and produce low viral titres in cell culture. Thus, for overcoming these difficulties in the cultivation of PCV2, this study aimed to develop a double-antibody sandwich ELISA based on the cell culture antigen PCV2b for the quantification of anti-PCV2 antibodies. A 20% and 50% discontinuous sucrose cushion was used for viral purification, which enabled the separation of cell culture proteins in the 20% sucrose cushion and a greater viral concentration in the 50% sucrose cushion. Following isopycnic centrifugation, PCV2 was concentrated in the band with density values from 1.330 to 1.395g/cm3. Viral purification was assessed using SDS-PAGE, indirect ELISA and electron microscopy. The standardised ELISA revealed a strong linear correlation (r= 0.826, p<0.001) when compared with a commercial ELISA kit. The assay exhibited low variability (inter-assay coefficient of variation of 4.24% and intra-assay of 1.80%) and excellent analytical specificity conferred by the capture antibody produced in rabbit. Thus, this ELISA is a rapid, specific and convenient method for the detection of antibodies against PCV2 in studies of experimental and natural infection, and in monitoring the response to vaccination on commercial farms.

• Immunosorbent assay centrifugation porcine circovirus type 2 antibody

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Cruz T.F., Kanashiro T.M., Castro A.M.M.G., Baldin C.M., Richtzenhain L.J. & Araujo Jr J.P. 2016. A double-antibody sandwich ELISA based on the porcine circovirus type 2 (PCV2) propagated in cell culture for antibody detection. [Sandwich ELISA com duplo anticorpo baseado no circovirus suíno tipo 2 (PCV2) produzido em cultivo celular para detecção de anticorpos.] Pesquisa Veterinária Brasileira 36(12):1171-1177. Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: jpessoa@ibb.unesp.br, tfcruz@yahoo.com.br Há poucos relatos na literatura de métodos de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), para a detecção de anticorpos contra o circovírus suíno tipo 2 (PCV2), baseados em antígenos produzidos em cultivo celular, bem como uma escassez de trabalhos descrevendo técnicas de purificação viral para os membros da família Circoviridae. Isso ocorre, pois os circovírus são de difícil isolamento, não causam efeito citopático e produzem um baixo título viral em cultivo celular. Assim, para superar essas dificuldades encontradas no cultivo do PCV2, este estudo objetivou desenvolver um sandwich ELISA com duplo anticorpo, baseado no antígeno de PCV2 produzido em cultivo celular, para a quantificação de anticorpos anti-PCV2. Um colchão de sacarose descontínuo a 20% e 50% foi utilizado para a purificação viral, o qual possibilitou a separação das proteínas oriundas do cultivo celular no colchão de sacarose a 20% e uma maior concentração viral no colchão de sacarose a 50%. Com a ultracentrifugação isopícnica, o PCV2 ficou mais concentrado na banda com valores de densidade de 1,330 a 1,395g/cm3. A purificação viral foi avaliada pelas técnicas de SDS-PAGE, ELISA indireto e microscopia eletrônica. Assim, o método de ELISA padronizado revelou uma forte correlação linear (r = 0,826, p <0,001) quando comparado com um kit de ELISA comercial. O ensaio demonstrou baixa variabilidade (coeficientes de variação inter-teste de 4,24% e intra-teste de 1,80%) e uma excelente especificidade analítica conferida pelo anticorpo de captura produzido em coelho. Portanto, o método de ELISA demonstrou ser rápido, específico e conveniente para a detecção de anticorpos contra o PCV2 em estudos de infecção natural e experimental, além da monitoria da resposta à vacinação contra o PCV2 em granjas comerciais.